Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/9386
Title: Diversity and ecology of entomopathogenic fungi in the Douro wine region of Portugal
Authors: Sharma, Lav
Advisor: Marques, Guilhermina Miguel Da Silva
Torres, Laura Monteiro
Keywords: Applied soil ecology
molecular ecology
fungal entomopathogens
soil chemistry
Issue Date: 7-May-2019
Abstract: Investigations studying diversity and factors affecting the abundance of entomopathogenic fungi (EPF) populations, the natural enemies of insects, are limited. In this work, culture based techniques and molecular biology tools were applied to investigate the natural diversity of EPF in the vineyards of the Douro wine region (DWR) of Portugal. Two different approaches were undertaken in this direction. First approach was the sampling of naturally mycosed insect-pest, i.e., vine mealybug Planococcus ficus, which is a major grapevine pest worldwide, and whose numbers are increasing in the DWR. Vine mealybugs were observed in two of the four farms searched for their presences. Out of 183 vine mealybugs collected, 58 were dead of which 25 presented symptoms of mycosis and 13 were parasitized. Subculturing and subsequent pathogenicity confirmation led to the isolation of 22 fungi including yeasts. Yeast Meyerozyma (=Pichia) guilliermondii, and EPF Sarocladium kiliense and Purpureocillium lilacinum were the most abundant, i.e., 18.18%, 13.64% and 13.64%, respectively. To our knowledge, this work reported (a) the first isolations of EPF from vine mealybug worldwide, and, (b) first isolation of Pseudocosmospora rogersonii in Europe, and as EPF worldwide. It was noticed that P. ficus mortalities originated by mycoses were significantly higher than by its parasitoids (P=0.026). Second approach was the sampling of 183 soils from the vineyards and adjacent hedgerows of the six wine farms, Arnozelo, Aciprestes, Carvalhas, Cidrô, Granja and S. Luiz, to isolate EPF using common bait-insect Tenebrio molitor (TM). Moreover, to study the effect of insect baiting on EPF recovery, 81 of these soils were also baited with Galleria mellonella (GM). Twelve species were found in 44.26%±3.67% soils. Clonostachys rosea f. rosea was found in maximum soils (30.05%±3.38%), followed by Beauveria bassiana (12.57%±2.37%), P. lilacinum (9.29%±2.14%) and Metarhizium robertsii (6.01%±1.75%). Beauveria pseudobassiana (P=0.038) and M. robertsii (P=0.003) were isolated significantly more using GM and TM, respectively. Principal component analysis revealed that M. robertsii was associated both with TM baiting and cultivated habitats, however, B. bassiana was slightly linked with GM baiting only. To us, this was thefirst report of: C. cicadae isolation from Mediterranean soils; Purpureocillium lavendulum as an EPF worldwide; and significant recoveries of M. robertsii using TM over GM. Based on these results, a ‗Galleria-Tenebrio-bait method‘ was also advocated for EPF isolations. Moreover, this research focussed on how soil physicochemical properties affect EPF occurrences, as previous studies in this direction are very few. The work was divided based on the EPF of interest. The soil properties studied were: organic matter content, total organic carbon, total nitrogen, available potassium, available phosphorus, exchangeable cations such as K+ , Na+ , Ca2+ and Mg2+, pH, total acidity, degree of base saturation, and effective cation exchange capacity. Soils which yielded any of the four common EPF, i.e., B. bassiana, P. lilacinum, M. robertsii and C. rosea f. rosea, were studied and, in total, 42 soils were assessed. Beauveria bassiana was negatively affected by higher available P (P=0.02), exchangeable K-ions (P=0.016), and positively affected by higher soil pH_H2O (P=0.021). High exchangeable K-ions inhibited P. lilacinum (P=0.011) and promoted C. rosea f. rosea (P=0.03). Moreover, high available K also suppressed P. lilacinum (P=0.027). Metarhizium robertsii was inhibited by organic matter content (P=0.009), C:N (P=0.017), total N (P=0.007), and exchangeable Mg-ions (P=0.026), and promoted by exchangeable Na-ions (P=0.003). As soil chemistry affected B. bassiana and M. robertsii the most, a principal component analysis was performed to cluster three groups of fungi, i.e., (a) B. bassiana, (b) M. robertsii and (c) others. First three factors, F1, F2 and F3, could explain 73.81% of the variance, i.e., 38.10%, 20.62% and 15.09%, respectively. Nonetheless, it was noticed that soil properties such as higher soil pH and exchangeable Ca-ions have contrasting effects on EPF occurrences, as they promoted B. bassiana and inhibited M. robertsii. Fusarium oxysporum is generalised as an opportunistic insect-pathogen colonising weak or dead insects. Here, in other works, authors convincingly reviewed and argued the entomopathogenicity of F. oxysporum, and, using a generalised linear mixed model approach and 80 soils, reported that soil physicochemical properties hardly affect its natural abundance. Besides, in another parallel work, authors recommended amplifying region of translational elongation factor 1-alpha subunit for identifying any random ascomycetous fungus. Nonetheless, this research provides important insights into the ecology and diversity of EPF in the DWR, and would facilitate soil quality predictions and subsequent soil amendment practices, especially for a conservation biological control viewpoint.
A investigação na diversidade e fatores que influenciam a ocorrência das populações de fungos entomopatogénicos (FEP), inimigos naturais dos insetos, é escassa. Neste trabalho foram utilizados métodos baseados na cultura e técnicas de biologia molecular, através da amplificação de regiões genómicas de interesse, para investigar a diversidade das populações de FEP em vinhas da Região de vinhosdo Douro (RVD), em Portugal. Nesse sentido, foram utilizadas duas abordagens. A primeira abordagem consistiu na amostragem de insetos infetados, nomeadamente a cochonilha da vinha Planococcus ficus, uma das principais pragas da vinha a nível mundial e cuja incidência nas vinhas da RVD tem vindo a aumentar. A cochonilha da vinha foi registada em duas das quatro vinhas onde foi pesquisada a sua presença. Das 183 cochonilhas colhidas, 58 encontravam-se mortas, sendo que 25 apresentavam sintomas de micose e 13 encontravam-se parasitadas. O isolamento dos fungos e posterior confirmação da patogenicidade revelou a presença de 22 fungos, incluindo leveduras. A levedura Meyerozyma guilliermondii e os FEP Sarocladium kiliense e Purpureocillium lilacinum foram os mais abundantes, i.e., 18.18%, 13.64% e 13.64%, respetivamente. Segundo o nosso conhecimento, este trabalho refere (a) os primeiros isolamentos de FEP de cochonilha da vinha a nível mundial, e (b) o primeiro isolamento de Pseudocosmospora rogersonii na Europa, e como FEP a nível mundial. A mortalidade da cochonilha por FEP foi maior que pelos seus parasitoides (P=0.026). A segunda abordagem consistiu na amostragem de 183 solos de seis vinhas e áreas da bordadura para o isolamento de FEP utilizando Tenebrio molitor (TM) como culturaarmadilha. Para avaliar o efeito da escolha do inseto na cultura-armadilha na captura dos FEP, 81 destes solos foram também submetidos a cultura-armadilha com Galleria mellonella (GM). Foram identificadas doze espécies em 44.26%±3.67% dos solos. Clonostachys rosea f. rosea foi mais frequente (30.05%±3.38%), seguida de Beauveria bassiana (12.57%±2.37%), P. lilacinum (9.29%±2.14%) e Metarhizium robertsii (6.01%±1.75%). Beauveria pseudobassiana (P=0.038) e M. robertsii (P=0.003) foram significativamente isoladas em maior número utilizando GM e TM, respetivamente. A ACP revelou que M. robertsii estava ssociada ao uso de TM como inseto-armadilha e às áreas cultivadas, enquanto B. bassiana estava associada ao uso de GM. Segundo o nosso conhecimento este foi o primeiro isolamento de C. cicadae em solos da região Mditerrânica; a caracterização de Purpureocillium lavendulum como FEP a nível mundial; e aumento significativo na captura de M. robertsii utilizando TM em vez de GM. Com base nestes resultados é proposto o método ‗cultura-armadilha ―Galleria-Tenebrio” no isolamento de FEP. A investigação focou-se ainda em esclarecer como as propriedades físico-químicas do solo afetam as ocorrências de FEP. O trabalho foi dividido com base nos FEP de interesse. Foram estudados 42 solos onde se identificaram qualquer dos quatro FEP mais comuns, i.e., B. bassiana, P. lilacinum, M. robertsii e C. rosea f. rosea. Beauveria bassiana foi negativamente relacionada com teores mais elevados de P assimilável (p=0.02), ião de troca K + (p=0.016), e relacionado positivamente com valores mais elevados de pH_H2O (p=0.021) do solo. Elevados valores do ião de troca K+ inibiram P. lilacinum (p=0.011) e promoveram C. rosea f. rosea (p=0.03). Teores elevados de K assimilável também suprimiram P. lilacinum (p=0.027). Metarhizium robertsii foi inibido pelo teor de matéria orgânica (p=0.009), C:N (p=0.017), N total (p=0.007), e pelos iões de troca Mg2+ (p=0.026), e promovido pelos iões de troca Na+ (p=0.003). Como as propriedades químicas do solo influenciaram principalmente B. bassiana e M. robertsii, foi realizada uma análise de componentes principais aos 3 grupos de fungos: (a) B. bassiana, (b) M. robertsii e (c) outros. Os primeiros 3 factores, F1, F2 e F3, explicaram 73.81% da variância, ou seja, 38.10%, 20.62% e 15.09%, respetivamente. Verificou-se que propriedades do solo como pH mais elevado e iões de troca de Ca2+ têm efeitos contrastantes nas ocorrências de FEP, uma vez que promovem B. bassiana e inibem M. robertsii. Também neste trabalho, é demonstrada e argumentada a entomopatogenicidade de Fusarium oxysporum, e, recorrendo a um modelo linear generalizado misto e 80 solos, verificou-se que as propriedades físico-químicas do solo não afetam a sua abundância natural. Noutro trabalho paralelo, é recomendada a amplificação da região do fator de alongamento translacional 1-α para identificar qualquer fungo ascomiceta. Este trabalho revela aspetos importantes da ecologia e diversidade de FEP na região dos vinhos do Douro e pode facilitar a previsão da qualidade e subsequentes práticas culturais, especialmente do ponto de vista da conservação do controlo biológico.
Description: Doctorate (Ph.D.) in Agronomic and Forest Sciences
URI: http://hdl.handle.net/10348/9386
Document Type: Doctoral Thesis
Appears in Collections:DAGRO - Teses de Doutoramento
TD - Teses de Doutoramento

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