Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/9642
Title: Antiproliferative and antioxidant role of selected flavonoids: a cellular approach
Authors: Durães, Tiago José Monteiro
Advisor: Silva, Amelia Maria Lopes Dias Da
Santos, Dario Joaquim Loureiro dos
Keywords: Bioquímica
flavonoides
Issue Date: 12-Sep-2019
Abstract: Os flavonoides são uma classe de fitoquímicos extremamente importante, quer pela sua ubiquidade no reino Plantae, quer pela enorme presença que têm no dia-a-dia da vida humana, através da dieta e medicina (seja pelo seu uso na indústria farmacêutica ou na medicina tradicional). Nas plantas, desempenham várias funções, uma delas como mecanismo de defesa. Ao longo dos anos, o interesse por esta classe de compostos tem aumentado, sendo explorados os seus possíveis efeitos biológicos no organismo humano. No entanto, a enorme diversidade de compostos e interações com o organismo têm provado que tais estudos podem ser extremamente complexos e que ainda existe um grande caminho a percorrer para clarificar quais atividades biológicas realmente ocorrem, e quais os mecanismos subjacentes. Neste estudo vamos avaliar a atividade anti-proliferativa, antioxidante e antiinflamatória de três flavonoides, eriodictiol, kaempferol e quercetina. Através do método de Alamar Blue avaliámos a viabilidade celular (nas linhas celulares HaCaT, Caco-2, HepG2 e RAW 264.7) após exposição aos compostos a várias concentrações por 24 ou 48 horas. De um modo geral, os compostos induziram redução de viabilidade celular proporcional ao aumento de concentração e tempo de exposição; no entanto, raramente se atingiram valores menores que 50% de viabilidade, com concentrações até 25 µM a causar pouco ou nenhum impacto, 100 µM a provocar as maiores reduções e 50 µM a variar entre os dois comportamentos. Relativamente à capacidade antioxidante, foi avaliada a capacidade de os compostos atuarem como radical scavengers contra os radicais ABTS•+ e •OH onde demonstraram um aumento de capacidade com a concentração. Através de citometria de fluxo, avaliámos o nível de espécies reativas de oxigénio (ROS) intracelular, de glutationa (GSH) e de peroxidação lipídica, assim como o potencial de membrana mitocondrial em células HepG2, após exposição, por 24 h, com 25, 50 e 100 µM dos compostos. Não se registou redução de potencial de membrana mitocondrial ou peroxidação lipídica. Os níveis de GSH revelaram aumento proporcional à concentração; simultaneamente, os compostos eriodictiol e quercetina induziram ligeiros aumentos nos níveis intracelulares de ROS, no entanto apenas significativo para 100 µM de quercetina; enquanto o kaempferol induziu ligeira diminuição de ROS a 25 e 50 µM, porém a 100 µM registou ligeiro aumento semelhante aos restantes flavonoides testados. O índice de stresse oxidativo calculado sugere que os compostos possam ter um efeito maioritariamente antioxidante, apesar de ligeiros aumentos de ROS. A atividade anti-inflamatória foi avaliada através de dois ensaios: no primeiro, onde se testou a capacidade de os compostos atuarem como scavengers de radicais perante o NO• , verificando-se que os compostos exibiram uma resposta proporcional ao aumento da concentração de composto, semelhante aos ensaios com os radicais ABTS•+ e •OH; no segundo, utilizando a linha celular RAW 264.7, onde se verificou que os compostos inibiriam parcialmente a quantidade de NO no sobrenadante, após estimulação das células com LPS. Após análise dos resultados, os compostos testados revelarem ter capacidade antioxidante e anti-inflamatória apresentando de modo geral baixa cito-toxicidade.
Flavonoid compounds are an extremely important class of phytochemicals, either due to their ubiquity in Plantae kingdom, either by their presence on human life, mainly through diet and medicine (both pharmaceutical industry and traditional medicine). They have multiple functions on plants; one of them is defence mechanism. Over the years the interest on these compounds has risen, although due to the huge structural diversity of flavonoids and their interaction with human organism, the study of the flavonoidinduced biological activities still needs a lot of research to clarify the specific activities that may occur and their underlying mechanisms. In this study we evaluated the anti-proliferative, antioxidant and anti-inflammatory activities of the flavonoids eriodictyol, kaempferol and quercetin. Recurring to Alamar Blue method we assessed the cellular viability (using HaCaT, Caco-2, HepG2 and RAW 264.7 cell lines) after exposure to 10, 25, 50 and 100 µM of compounds, during 24 or 48 hours. Generally, compounds induced a dose- and time-dependent decrease in cell’s viability; still, viability values rarely dropped under 50%. Concentrations up to 25 µM induced low or none impact on cell’s viability, 100 µM induced the highest reduction and 50 µM varying between the two behaviours. Antioxidant activity was evaluated by: i) Radical scavenging activity, towards ABTS•+ and •OH where a dose-dependent increase was observed; ii) Recurring to flow cytometry, after exposure of HepG2 cells to 25, 50 and 100 µM of flavonoids during 24 h, the levels of ROS, glutathione and lipid peroxidation, as well as mitochondrial membrane potential (ΔΨm) were assessed. Lipid peroxidation and decrease of ΔΨm was not observed. GSH levels increased in a dosedependent way; ROS levels also increased dose-dependently, for eriodictyol and quercetin (although, only significant to 100 µM of quercetin), while kaempferol produced a slight decrease of ROS at 25 and 50 µM and an increase, although not significant, at 100 µM similarly to the other compounds. Oxidative stress index calculated supports the idea that these flavonoids may overall act as antioxidants, despite slight increases of ROS. Anti-inflammatory potential was evaluated through two assays. Firstly, the in vitro radical scavenging activity towards NO• , where results identical to those of ABTS•+ and •OH, a dose-dependent increase, were observed. Secondly, using the RAW 264.7 cell line, after exposure to 10 and 20 µM of flavonoids during 24 h, was stimulated by LPS and it was observed that the compounds were able to partially inhibit the LPS-induced NO formation. Overall, all compounds tested revealed antioxidant and anti-inflammatory capacity, with general low levels of cytotoxicity.
Description: Dissertação de Mestrado em Bioquímica
URI: http://hdl.handle.net/10348/9642
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:DQUI - Dissertações de Mestrado
TD - Dissertações de Mestrado

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