Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/9643
Title: Espetrometria de massa aplicada à microbiologia clínica moderna: pesquisa e identificação de biomarcadores em espécies bacterianas multirresistentes
Authors: Sousa, Telma Susana Lopes de
Advisor: Igrejas, Gilberto Paulo Peixoto
Hébraud, Michel
Keywords: MALDI-TOF MS
Enterococcus spp.
Issue Date: 28-Oct-2019
Abstract: O uso excessivo de antibióticos na produção animal e no meio hospitalar tem vindo a condicionar uma pressão de seleção significativa nas estirpes bacterianas, resultando no aparecimento de estirpes cada vez mais resistentes a estes antibióticos. Estas resistências são progressivamente um obstáculo para a saúde humana. Um dos mecanismos mais importantes desta resistência é a atividade das β-lactamases de amplo espetro (ESBL) que confere resistência a vários antibióticos designadamente as cefalosporinas de terceira e quarta geração. Outro exemplo significativo desta problemática é a existência de estirpes de Enterococos Resistentes à Vancomicina (VRE), que pode indicar a inexistência de barreiras entre hospitais, população e animais. Neste contexto, os objetivos deste trabalho consistiram em caracterizar fenotipicamente e genotipicamente os isolados de Escherichia coli e Enterococcus spp. e detetar putativos biomarcadores de resistência aos antibióticos através da técnica MALDI-TOF MS. A grande maioria das amostras de E. coli e todas as amostras de Enterococcus spp. possuíam multirresistência. A maioria dos isolados de E. coli na caracterização fenotípica evidenciavam resistência ao trimethoprim-sulfamethoxazole (80%), tetraciclina (63%) e ampicilina (57%), enquanto os isolados de Enterococcus spp. demonstraram resistência elevada à vancomicina (100%), teicoplanina (95%) e tetraciclina (90%). No que respeita a caracterização genotípica dos isolados de E. coli, os genes tet(A) e tet(B) detetaram-se em estirpes que apresentaram resistência à tetraciclina. Todas as estirpes codificavam genes para a produção de ESBL comprovando a resistência aos antibióticos β-lactâmicos em bactérias Gram-negativas. Neste estudo tivemos uma maior prevalência de blaCTXM (77%) em comparação com blaSHV e blaTEM, 10% e 37%, respetivamente. Em Enterococcus spp., todos os isolados que mostraram resistência à vancomicina, apresentam o genótipo vanA. Foram também detetados os genes tet(L), tet(K) e tet(M) em estirpes que mostraram resistência à tetraciclina. Vários estudos estão de acordo com os resultados obtidos neste trabalho. Uma estirpe de enterococos, E. durans, apresentou resistência à estreptomicina de alta carga, contendo o gene ant(6)-Ia. Na análise proteómica, via MALDI-TOF MS, para a deteção de massas proteicas associadas às diversas resistências, obtiveram-se vários picos estatisticamente significativos. Para os isolados de E. coli o antibiótico que demonstrou ter mais picos identificados foi o trimethoprim-sulfamethoxazole e para os isolados de ententerococos foi a eritromicina. Todos os dados obtidos foram analisados no software ClinProTools. O pico m/z 4428 ± 3 Da foi encontrado exclusivamente em isolados de enterococos enquanto que para E. coli, a massa m/z 4528,36 Da evidenciou-se como específica para esta espécie, podendo ser um potencial biomarcador para as respetivas estirpes. Em suma, o pico m/z 2943,29 Da para o antibiótico ampicilina, nas amostras de E. coli e os picos m/z 6358,27 Da e m/z 13237,3 Da para o antibiótico ciprofloxacina nos isolados de Enterococcus spp foram identificados como biomarcadores putativos para estes antibióticos. Estes resultados vêm reforçar a relevância da abordagem MALDI-TOF MS para a caracterização bacteriana clínica, tendo sido detetados picos de massa específicos dos dois géneros estudados e picos de massa caracterizadores das diferentes espécies do género enterococos e Escherichia coli.
With the excessive use of antibiotics in animal production and in the hospital environment, bacterial strains are subject to a significant selective pressure, which results in the emergence of strains with a progressive resistant nature. These resistances are gradually seen as an obstacle to human health. One of the most important mechanisms of resistance is the activity of Extended-Spectrum Beta-Lactamases (ESBL) that confer resistance to various antibiotics such as third and fourth generation cephalosporins. Another significative example of this growing concern is the case of VRE (Enterococci Resistant to Vancomycin) strains that may indicate the absence of barriers between hospitals, population and animals. In this context, the objectives of this study were to characterize phenotypically and genotypically isolates of Escherichia coli and Enterococcus spp. and detect putative biomarkers of resistance to antibiotics detected through the MALDI-TOF MS technique. The vast majority of E. coli samples and all samples of Enterococcus spp. were multiresistant. In the phenotypic characterization most isolates of E. coli showed resistance to trimethoprim-sulfamethoxazole (80%), tetracycline (63%) and ampicillin (57%) while enterococcus spp. isolates exhibited high resistance to vancomycin (100%), teicoplanin (95%) and tetracycline (90%). In the genotypic characterization of E. coli isolates, the tet(A) and tet(B) genes were detected in strains that showed resistance to tetracycline. All strains encode genes for the production of Extended-Spectrum Beta-Lactamase proving the resistance to βlactam antibiotics in gram-negative bacteria. In this study, we had a higher prevalence of blaCTXM (77%) compared to blaSHV and blaTEM, 10% and 37%, respectively. All Enterococcus spp strains that underwent vancomycin exposure, exhibit the vanA genotype. The genes were also detected tet(L), tet(K) and tet(M), in strains that showed resistance to tetracycline. Several studies are in accordance with the results obtained in this study. A strain of Enterococci, E. durans presented resistance to high-load streptomycin, containing the ant(6)-Ia gene. In the proteomic analysis, by MALDI-TOF MS, for the detection of protein masses associated with the various resistances, several statistically significant peaks were obtained, and for the isolates of E. coli the antibiotic that showed more peaks identified was trimethoprimsulfamethoxazole and for the isolates of Ententerococci was erythromycin. All data obtained were analysed in the ClinProTools software. The peak m/z 4428 ± 3, was found exclusively in isolates of Enterococci while the mass m/z 4528.36 Da was specific for E. coli, that may be evidenciated as a potential biomarker For the respective strains. In short, we identified the peak m/z 2943.29 Da for the antibiotic ampicillin, in the samples of E. coli and the peaks m/z 6358.27 da and M/z 13237.3 da for the antibiotic ciprofloxacin in the isolates of Enterococcus spp as putative biomarkers for those resistances. These results reinforce the relevance of the MALDI-TOF MS approach to clinical bacterial characterization, with specific mass peaks detected from the two genera studied and peaks of mass characterizers of the different species of the genus Enterococci and Escherichia coli.
Description: Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
URI: http://hdl.handle.net/10348/9643
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:DGB - Dissertações de Mestrado
TD - Dissertações de Mestrado

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