Screening of kinase inhibitors that modulate 1-deoxysphingolipid production in a mammalian cell culture model
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2014
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Resumo
Os desoxiesfingolipidos (1-deoxySLs) são uma classe atípica de esfingolípidos (SLs) formados devido à permissividade da enzima serina-palmitoiltransferase (SPT) a qual usa L-alanina em vez do seu substrato natural L-serina. Algumas mutações missense na enzima SPT causam um aumento na produção de 1-deoxySLs, sendo esta uma Hallmark para pacientes que possuem a doença rara denominada neuropatia autonómica e sensorial hereditária do tipo I (HSAN1). Apesar da ausência de mutações na enzima SPT, os níveis de 1-deoxySLs também se encontram elevados em pacientes com síndrome metabólico (MetS) ou em pacientes com diabetes mellitus tipo II (T2DM). Os níveis de 1-deoxySLs diminuíram tanto em pacientes como em modelos animais com HSAN1 após serem suplementados com L-serina, revelando-se também a melhoria do fenótipo característico da doença. Também em modelos animais diabéticos se verificou que o suplemento com L-serina diminuiu os valores de 1-deoxySLs. Apesar de a L-serina representar uma estratégia segura, barata e eficaz, é necessário encontrar moléculas mais pequenas com um melhor perfil farmocinético e um IC50 menor que produzam os mesmos efeitos que a L-serina.
Com este trabalho pretendeu-se identificar pequenas moléculas bioativas que reduzissem a produção de 1-deoxySLs. A produção de 1-deoxySLs in vitro pode ser induzida, em diferentes linhagens celulares, prolongando o tempo de cultura das células até estas atingirem uma confluência de 100 %. Usando o LC/MS e um conjunto de inibidores de cinases, desenvolveu-se um método de seleção para identificar pequenas moléculas bioativas que inibem a produção de 1-deoxySLs. Testaram-se 60 inibidores, no conjunto da primeira fase e da fase confirmatória. Os resultados positivos foram posteriormente testados em linhas celulares em que as mutações mais comuns da enzima SPT estavam overexpressed.
Os resultados obtidos mostram que a inibição das enzimas IGF-1R e AKT conduziram não só a uma significativa inibição da produção de 1-deoxySLs, como não afetaram a produção dos SLs canónicos. Isto foi demonstrado nas duas fases e com diferentes inibidores a inibir a mesma cinase. Após estudar a inibição cinética destes inibidores em 1-deoxySLs verificou-se que estes possuem um IC50 menor que a serina (escala em nM em comparação com μM da serina). Contudo, estes inibidores não reduziram a produção de 1-deoxySLs nas linhagens celulares mutantes HSAN1 SPTLC1, indicando que o mecanismo de produção de 1-deoxySLs em células Wt e em células mutadas é diferente.
Em resumo, desenvolveu-se um método simples de seleção para identificar modeladores de 1-deoxySLs; tendo sido identificado que a inibição de IGF-1R e AKT diminuiu os níveis de 1-deoxySLs em Wt SPT mas não nas células com mutações HSAN1 na enzima SPT. Perspetiva-se, desta forma, investigação para outros estudos que pretendam averiguar o mecanismo pelo qual IGF-1R e AKT regulam a produção de 1-deoxySLs. Complementarmente, oferece também uma potencial alternativa terapêutica na diminuição de 1-deoxySLs em pacientes que, apesar de não possuírem mutações na enzima SPT, revelam elevados níveis de 1-deoxySLs.
Deoxysphingolipids (1-deoxySLs) are atypical sphingolipids (SLs) that are formed by the enzyme serine-palmitoyltransferase (SPT) due to the promiscuous use of L-alanine instead of its canonical substrate L-serine. Several missense mutations in SPT lead to increased 1-deoxySLs production, which is the hallmark of the rare hereditary sensory and autonomic neuropathy type 1 (HSAN1). 1-deoxySLs levels are also elevated in the plasma of patients with metabolic syndrome (MetS) or type 2 diabetes mellitus (T2DM) despite the absence of mutations in SPT. Supplementation with L-serine lowered 1-deoxySLs levels and improved the neuropathy phenotype in HSAN1 patients and animal models, as well as in a diabetic animal model. Although L-serine is a safe, cheap and effective strategy, there is a need for small molecules that lower 1-deoxySLs with a better pharmacokinetic profile and a lower IC50. In this work, we aimed to identify bioactive small molecules that lower 1-deoxySLs production. In vitro, 1-deoxySLs production could be induced in several cell lines by the prolonged culturing of cells at 100 % confluency. Using LC/MS and a kinase inhibitor library, we developed a screening workflow to identify bioactive small molecules that inhibit the production of 1-deoxySLs in this late culture model. We screened ~ 60 different kinase inhibitors in primary and confirmatory screens. The positive hits were then tested with cell lines overexpressing the most common SPT mutations. Our results show that IGF-1R and AKT inhibition leads to a robust and significant inhibition of 1-deoxySLs production whereas the production of canonical SLs is not affected in the same way. This was shown in both primary and confirmatory screen and using multiple drugs inhibiting the same kinase. By studying the 1-deoxySLs inhibition kinetics of these drugs, we showed that they have a lower IC50 than L-serine (nM compared to μM range of serine). However, these inhibitors didn’t lower the production of 1-deoxySLs of HSAN1 SPTCL1 mutants, indicating that the mechanism of production of 1-deoxySLs by WT and mutated SPT is different. In summary, we developed a robust simple screening workflow to identify modulators of 1-deoxySLs. We identified that IGF-1R and AKT inhibition lower 1-deoxySls levels in Wt SPT but not in HSAN1 SPT mutant cells. This paves the way for further studies dissecting the mechanism by which IGF-1R and AKT regulate 1-deoxySL production. This also offers an alternative therapeutic potential to lower 1-deoxySLs in patients with elevated levels but without a mutation in SPT.
Deoxysphingolipids (1-deoxySLs) are atypical sphingolipids (SLs) that are formed by the enzyme serine-palmitoyltransferase (SPT) due to the promiscuous use of L-alanine instead of its canonical substrate L-serine. Several missense mutations in SPT lead to increased 1-deoxySLs production, which is the hallmark of the rare hereditary sensory and autonomic neuropathy type 1 (HSAN1). 1-deoxySLs levels are also elevated in the plasma of patients with metabolic syndrome (MetS) or type 2 diabetes mellitus (T2DM) despite the absence of mutations in SPT. Supplementation with L-serine lowered 1-deoxySLs levels and improved the neuropathy phenotype in HSAN1 patients and animal models, as well as in a diabetic animal model. Although L-serine is a safe, cheap and effective strategy, there is a need for small molecules that lower 1-deoxySLs with a better pharmacokinetic profile and a lower IC50. In this work, we aimed to identify bioactive small molecules that lower 1-deoxySLs production. In vitro, 1-deoxySLs production could be induced in several cell lines by the prolonged culturing of cells at 100 % confluency. Using LC/MS and a kinase inhibitor library, we developed a screening workflow to identify bioactive small molecules that inhibit the production of 1-deoxySLs in this late culture model. We screened ~ 60 different kinase inhibitors in primary and confirmatory screens. The positive hits were then tested with cell lines overexpressing the most common SPT mutations. Our results show that IGF-1R and AKT inhibition leads to a robust and significant inhibition of 1-deoxySLs production whereas the production of canonical SLs is not affected in the same way. This was shown in both primary and confirmatory screen and using multiple drugs inhibiting the same kinase. By studying the 1-deoxySLs inhibition kinetics of these drugs, we showed that they have a lower IC50 than L-serine (nM compared to μM range of serine). However, these inhibitors didn’t lower the production of 1-deoxySLs of HSAN1 SPTCL1 mutants, indicating that the mechanism of production of 1-deoxySLs by WT and mutated SPT is different. In summary, we developed a robust simple screening workflow to identify modulators of 1-deoxySLs. We identified that IGF-1R and AKT inhibition lower 1-deoxySls levels in Wt SPT but not in HSAN1 SPT mutant cells. This paves the way for further studies dissecting the mechanism by which IGF-1R and AKT regulate 1-deoxySL production. This also offers an alternative therapeutic potential to lower 1-deoxySLs in patients with elevated levels but without a mutation in SPT.
Descrição
Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde
Palavras-chave
Química , Cromatografia , Espetrometria , Cultura de células , Enzimas