Gene discovery in pediatric immune and inflammatory diseases
Data
2018-01-11
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Resumo
Primary immunologic diseases are a newly recognized and expanding group of autoinflammatory and autoimmune diseases characterized by a genetic predisposition for immune system dysregulation. Most of them have not been yet genetically characterized as they include a wide range of heterogeneous conditions. In the current work, we used next generation sequencing, specifically whole-exome sequencing. We applied an established GATK pipeline for processing the data and performed variant filtering to find novel or known genetic mutations in young patients with rare autoimmune/autoinflammatory disorders. In most of the cases, these patients were analyzed as part of a family trio with or without siblings. Through this pipeline and filtering, we were able to propose disease causing mutations and suggest new disease mechanistic pathways in some of the families. Furthemore, we have scrutinated CECR1 gene in patients with ADA2 deficiency and discovered both new and reported mutations that cause the reduced enzymatic activity. Additionally, we analyzed patients affected with the polygenic disease, Juvenile Idiopathic Artritis, and discovered two rare mutations in the known gene for JIA, IL6R. Promising candidate mutations from exome-sequencing were taken forward for confirmation by SANGER sequencing. In this thesis, we describe the pitfalls of exome-sequencing and the important information, apart from biological function, that has to be taken into consideration for choosing a candidate variant. We conclude that although whole exome sequencing is indeed very useful for identifying the genetic cause of Mendelian diseases, such as PID, this process is not always straightforward as very complex and time-consuming functional tests are always necessary for confirming the exact role of the mutation in the disease pathogenesis.
Doenças imunológicas primárias são um grupo recentemente reconhecido e em expansão de um conjunto de patologias auto inflamatórias e autoimunes, em que os indivíduos afetados apresentam predisposição genética para a desregulação do sistema imunitário. A maioria destas patologias ainda não foram geneticamente caracterizadas devido à grande diversidade de características heterogéneas que apresentam. No presente trabalho foi utilizada a nova geração de sequenciação (Next-generation sequencing), especificamente a sequenciação de todo o exoma (Whole- Exome Sequencing: WES). Além disso, utilizamos um protocolo desenvolvido pela GATK (Genome Analysis Toolkit) para processar os dados resultantes da sequenciação e aplicamos uma série de filtros em todas as variantes de forma a encontrar mutações genéticas novas, ou referenciadas em jovens pacientes com doenças autoimunes e/ou auto inflamatórias raras. Na maior parte dos casos foram analisados os pacientes e os pais (designado “trio design”), por vezes também os irmãos e esporadicamente indivíduos isolados. Através do protocolo e da filtragem utilizada, foi possível sugerir novas mutações patogénicas ou, pelo menos, mutações que causam dano na proteína final, e também, sugerir novas vias e mecanismos que podem levar ao aparecimento das doenças. Além disso, escrutinamos molecularmente o gene CECR1 em pacientes com deficiência na proteína ADA2, identificando mutações novas e também mutações anteriormente referenciadas que causam a redução da atividade enzimática. Adicionalmente, analisamos pacientes afetados com uma doença poligénica, a artrite idiopática juvenil, e descobrimos duas mutações raras no gene IL6R, gene implicado no desenvolvimento desta doença. Mutações candidatas promissoras obtidas a partir da WES foram confirmadas por sequenciação de SANGER. Nesta tese descrevemos também algumas falhas da WES e a informação que deve ser levada em consideração para a escolha de uma variante candidata, excetuando a função biológica. Concluímos que a WES é de facto muito pratica e útil na identificação da causa genética das doenças mendelianas, como as doenças primárias imunológicas, mas no entanto, este processo de identificação não é linear sendo, obrigatoriamente, necessários testes funcionais complexos e exaustivos para confirmar o papel exato da mutação na doença.
Doenças imunológicas primárias são um grupo recentemente reconhecido e em expansão de um conjunto de patologias auto inflamatórias e autoimunes, em que os indivíduos afetados apresentam predisposição genética para a desregulação do sistema imunitário. A maioria destas patologias ainda não foram geneticamente caracterizadas devido à grande diversidade de características heterogéneas que apresentam. No presente trabalho foi utilizada a nova geração de sequenciação (Next-generation sequencing), especificamente a sequenciação de todo o exoma (Whole- Exome Sequencing: WES). Além disso, utilizamos um protocolo desenvolvido pela GATK (Genome Analysis Toolkit) para processar os dados resultantes da sequenciação e aplicamos uma série de filtros em todas as variantes de forma a encontrar mutações genéticas novas, ou referenciadas em jovens pacientes com doenças autoimunes e/ou auto inflamatórias raras. Na maior parte dos casos foram analisados os pacientes e os pais (designado “trio design”), por vezes também os irmãos e esporadicamente indivíduos isolados. Através do protocolo e da filtragem utilizada, foi possível sugerir novas mutações patogénicas ou, pelo menos, mutações que causam dano na proteína final, e também, sugerir novas vias e mecanismos que podem levar ao aparecimento das doenças. Além disso, escrutinamos molecularmente o gene CECR1 em pacientes com deficiência na proteína ADA2, identificando mutações novas e também mutações anteriormente referenciadas que causam a redução da atividade enzimática. Adicionalmente, analisamos pacientes afetados com uma doença poligénica, a artrite idiopática juvenil, e descobrimos duas mutações raras no gene IL6R, gene implicado no desenvolvimento desta doença. Mutações candidatas promissoras obtidas a partir da WES foram confirmadas por sequenciação de SANGER. Nesta tese descrevemos também algumas falhas da WES e a informação que deve ser levada em consideração para a escolha de uma variante candidata, excetuando a função biológica. Concluímos que a WES é de facto muito pratica e útil na identificação da causa genética das doenças mendelianas, como as doenças primárias imunológicas, mas no entanto, este processo de identificação não é linear sendo, obrigatoriamente, necessários testes funcionais complexos e exaustivos para confirmar o papel exato da mutação na doença.
Descrição
DECLARATION AND CONFIDENTIALITY
I Pedro Eduardo Moreno Cardoso confirm that the work presented in this thesis is my own. Where information has been derived from other sources, I confirm that this has been indicated in the thesis.
This study is confidential and all the information here present belongs to Translation and Immunology Laboratory, therefore all the information and experiment results here described should be only used for evaluation purposes.